ELISA實驗失敗可能由多種因素引起，以下是一些常見問題及解決方案，按實驗步驟分類：
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### **1. 樣本問題**
- **樣本質量差**：溶血、脂血或反復凍融導致蛋白降解。  
  *解決*：使用新鮮樣本，避免反復凍融，離心去除沉淀。
- **樣本濃度異常**：目標物濃度過高（鉤狀效應）或過低。  
  *解決*：預實驗確定稀釋比例，過高時需梯度稀釋。
- **基質效應**：血清/血漿中干擾物質（如異嗜性抗體、RF因子）。  
  *解決*：稀釋樣本或使用阻斷劑（如HBR緩沖液）。
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### **2. 試劑問題**
- **抗體失效**：儲存不當（未避光或反復凍融）或過期。  
  *解決*：分裝保存，避免反復凍融；驗證抗體效價。
- **酶標物失活**：HRP/AP酶受疊氮鈉抑制或保存不當。  
  *解決*：避免使用含疊氮鈉的緩沖液，4℃避光保存。
- **洗滌液殘留**：洗滌不徹di導致背景高，或過度洗滌丟失信號。  
  *解決*：確保洗滌液新鮮配制，每孔加液量一致，拍干但不干燥孔板。
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### **3. 操作問題**
- **包被不均**：抗原/抗體包被濃度或時間不足。  
  *解決*：優化包被條件（4℃過夜或37℃ 2小時），使用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）。
- **封閉不充分**：非特異性結合導致高背景。  
  *解決*：更換封閉劑（如BSA、脫脂奶粉），延長封閉時間（1-2小時）。
- **孵育條件不當**：溫度或時間不統一。  
  *解決*：使用恒溫搖床，嚴格計時，避免孔間交叉污染。

### **4. 檢測問題**
- **顯色異常**：底物失效（如TMB結晶或變色）、顯色時間過長。  
  *解決*：避光保存底物，顯色時間控制在10-15分鐘（HRP-TMB）。
- **讀數錯誤**：酶標儀波長設置錯誤（如TMB用450nm，OPD用492nm）。  
  *解決*：核對說明書，確保濾光片匹配。
- **標準曲線不佳**：標準品稀釋錯誤或復溶不wan全。  
  *解決*：精確稀釋，混勻標準品，繪制雙對數坐標驗證線性。
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### **5. 其他問題**
- **板孔邊緣效應**：邊緣孔蒸發速率不同。  
  *解決*：使用封板膜，避免邊緣孔用于關鍵樣本。
- **交叉污染**：加樣時槍頭觸碰孔壁或液體飛濺。  
  *解決*：更換槍頭，使用多通道移液器校準。
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### **排查流程建議**
1. **對照分析**：檢查陰性/陽性對照是否正常。  
2. **重復實驗**：排除偶然誤差。  
3. **分步驗證**：更換關鍵試劑（如抗體、酶標物）或調整孵育時間。  

通過系統排除法定位問題，可顯著提高實驗成功率。